酵母人工染色體定義及工作原理 | | 旗凱

告訴你酵母人工染色體定義及工作原理。近日國際頂級學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》以封面的模式同時刊發(fā)了中國除草安全劑科學(xué)家的4篇研究長文！由天津大學(xué)、清華大學(xué)和華大基因分別完成的這4篇長文，介紹了生物合成研究的最新突破：完成了4條真核生物釀酒酵母染色體的從頭設(shè)計與化學(xué)合成——要知道，釀酒酵母總共有16條染色體，此前國際同行奮斗多年才發(fā)現(xiàn)了1條。

酵母人工染色體定義

酵母人工染色體（Yeast artificial chromosomes 簡稱YAC），是一種能夠克隆長達400Kb的DNA片段的載體，含有酵母細胞中必需的端粒、著絲點和復(fù)制起始序列。是細胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體（染色質(zhì)）；其本質(zhì)是脫氧核苷酸，是細胞核內(nèi)由核蛋白組成、能用堿性染料染色、有結(jié)構(gòu)的線狀體，是遺傳物質(zhì)基因的載體。

酵母人工染色體工作原理

YAC 載體主要是用來構(gòu)建大片段 DNA 文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。圖3-26是 pYAC4 的遺傳結(jié)構(gòu)圖，當用BamHⅠ切割成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中能夠驅(qū)動染色體的復(fù)制和分配，從而決定這個微型染色體能夠攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。圖3-27描述了YAC載體的原理性工作流程。對于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色體，當用EcoRⅠ或SmaⅠ切割克制基因sup4 內(nèi)部的位點后形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細胞決裂分配到子細胞中去，達到克隆大片段DNA 的目標。裝載了外源DNA片段的重組子導(dǎo)致克制基因sup4插入失活，從而形成紅色菌落；而載體自身連貫后轉(zhuǎn)入到酵母細胞后形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源DNA 片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了 YAC 文庫。YAC文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達200-500kb，有的可達1Mb以上，甚至達到2Mb 。

YAC載體功能強大，但有一些弊端。這主要表現(xiàn)在3個方面：首先，在 YAC 載體的插入片段會出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的現(xiàn)象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個YAC中的插入片段由2個或多個的獨立基因組片段連貫組成。嵌合克隆約占總克隆的5%～50%。最后，YAC染色體與宿主細胞的染色體大小相近，影響了YAC 載體的寬泛應(yīng)用。YAC 染色體一旦進入釀酒酵母細胞，由于其大小與內(nèi)源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利于進一步剖析。但是YAC的一個突出優(yōu)點是，酵母細胞比大腸桿菌對不穩(wěn)定的、重復(fù)的和極端的DNA 有更強的容忍性。另外，YAC 在功能基因和基因組研究中是一個非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多數(shù)是多外顯子結(jié)構(gòu)并且有長長的內(nèi)含子，大型基因組片段可通過YAC 載體轉(zhuǎn)移到動物或動物細胞系中，進行功能研究。